簡化復(fù)雜的熒光多孔板檢測方法

點擊次數(shù)：1187 更新時間：2023-08-09

細胞凋亡或程序性細胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過程中以消除不需要的細胞，或者發(fā)生在成年人的愈合過程中，以消除身體的受損細胞，幫助預(yù)防癌癥。用多孔板進行的Caspase檢測實驗使研究人員能夠研究細胞凋亡的早期階段。在這篇文章中，我們展示了MICA如何與熒光多孔板測定一起應(yīng)用，以提供*時空相關(guān)性的數(shù)據(jù)，并將串?dāng)_降至zui di。

U2OS細胞在加入細胞凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素后，在13小時延時成像過程中拍攝標(biāo)記了SiR Actin、TMRE、CellEvent™和DAPI的圖像。

熒光檢測的基礎(chǔ)知識

多孔板對于需要更高通量的實驗非常有用。它們能讓用戶收集384、96或24個不同的平行實驗（或樣品）的數(shù)據(jù) [1]?，F(xiàn)代檢測試劑盒通常用熒光探針或染料來標(biāo)記感興趣的蛋白，然后再用熒光顯微鏡對每個孔板中熒光標(biāo)記的樣品進行分析[2,3]。高通量的熒光多孔板檢測在神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的很多實驗中都有廣泛的應(yīng)用。幸運的是，許多這類熒光檢測的試劑盒在市場上可以買到，這有助于大大簡化樣品制備，為用戶節(jié)省大量的時間和精力。

細胞凋亡和Caspase蛋白

細胞凋亡或程序性細胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過程中以消除不需要的細胞，或在成年人的愈合過程中消除身體的受損細胞，幫助預(yù)防癌癥[4-6]。Caspases家族（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一個大型的半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡的啟動和執(zhí)行中起著重要作用[5,6]。啟動型caspases幫助啟動細胞凋亡，而執(zhí)行型caspases進行大量蛋白水解。Caspase-3和caspase-7都是執(zhí)行者型caspases[5,6,7]。caspase-3在細胞凋亡過程中有協(xié)調(diào)細胞結(jié)構(gòu)破壞的作用，而caspase-7有細胞脫離的作用[7]。

Caspase測定法

Caspase檢測可以研究細胞凋亡的早期階段。在這里，我們研究了caspase-3和capase-7被細胞毒性藥物（如星形孢菌素）激活的劑量依賴性。為了消除隨機效應(yīng)，在相同的條件下用不同濃度的一種藥物或多種藥物的組合，對多個檢測樣本進行了研究。具有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果通常需要重復(fù)實驗數(shù)次。

Caspase檢測中的挑戰(zhàn)

caspase檢測透露的主要是caspase激活級聯(lián)開始時的信息。然而，關(guān)于單個細胞的其他形態(tài)學(xué)或激活反應(yīng)的問題仍未得到解答。Caspase檢測中加入更多的熒光染色劑可以獲得更多的信息，例如在凋亡過程中的細胞骨架行為或xi bao se su c介導(dǎo)的凋亡小體的組裝導(dǎo)致caspase-3和caspase-7切割途徑的激活[8]。在caspase檢測中要快速收集所有熒光標(biāo)簽的信號，從而實現(xiàn)在規(guī)定時間間隔獲取整個樣本板上的數(shù)據(jù)，可能是很困難的。其次，很難快速并可靠地分離多達四個熒光標(biāo)簽的信號。最后，如果數(shù)據(jù)的獲取與caspase活性的檢測不是同步的，它們就不直接相關(guān)。

由于這些挑戰(zhàn)，在進行caspase測定，特別是在結(jié)合額外的標(biāo)記以獲得更多信息時，常常會有一些擔(dān)憂。激活反應(yīng)前后和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)可能會丟失或沒有時空即位置和時間方面的相關(guān)性。另外，熒光標(biāo)簽之間的串?dāng)_也會導(dǎo)致對結(jié)果的誤解。

目前，大量的研究實驗室可能沒有現(xiàn)成的用于這些檢測工作的所有儀器和顯微鏡。這個問題通常通過使用多個研究小組和用戶的共享設(shè)備來解決，但這意味著可能需要很長時間才能獲得所需的儀器。

這些挑戰(zhàn)可能導(dǎo)致延遲獲得重要的、可量化的結(jié)果，而這些結(jié)果會影響根本性突破和獲得新的見解。

Mica介紹

Mica是全場景顯微成像分析平臺，它將研究人員需要的一切都統(tǒng)一在一個wan quan可控的、高度靈活的環(huán)境中，加速顯微鏡的工作流程，以便更快地獲得有意義的科學(xué)結(jié)果。通過使用這個顯微成像分析平臺，您可以從以下方面受益：

人人皆享：即使是沒有經(jīng)驗的用戶也能用MICA輕松設(shè)置復(fù)雜的檢測讀數(shù)。

觸手可及：MICA使得用戶能同時對4個標(biāo)記進行成像，具有*的時空相關(guān)性。

ji zhi簡化工作流程：MICA對4個標(biāo)記的同時采集以及后續(xù)AI驅(qū)動的數(shù)據(jù)分析都顯著減少了工作流程步驟。

方法

MICA用于熒光多孔板檢測來研究caspase-3和caspase-7在激活凋亡中的作用（圖1）。制備U2OS細胞相關(guān)樣品，最后用星形孢菌素處理以誘導(dǎo)細胞凋亡。本實驗有多個與凋亡早期階段相關(guān)的讀數(shù)。

結(jié)果

圖1結(jié)果顯示了星形孢菌素誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-7的激活，在此之前是應(yīng)力纖維的形成和線粒體膜電位的耗盡。

圖1：圖中顯示了實驗工作流程和caspase檢測的結(jié)果。

用MICA實現(xiàn)了4種熒光標(biāo)記物的絕對時空相關(guān)性，由此可以對凋亡誘導(dǎo)的早期進行監(jiān)測（參考視頻1和圖2）。觀察到應(yīng)力纖維的形成與caspase-3和caspase-7激活開始時線粒體膜電位的喪失相吻合。DNA凝結(jié)直接跟隨caspase激活。

視頻 1：U2OS細胞在63倍寬場模式下采集13小時的延時拍攝視頻。A) 細胞用SiR-Actin、TMRE（63倍放大，線粒體活性）、CellEvent™（caspase活性）和DAPI（細胞核）標(biāo)記。在t0加入凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素。

圖2：同一數(shù)據(jù)集，每列顯示單個時間點，每行顯示單個標(biāo)記。

圖3為傳統(tǒng)寬場顯微鏡和MICA的時空多色采集對比。熒光標(biāo)記的同步檢測在研究線粒體動力學(xué)時，消除了觀察線粒體結(jié)構(gòu)和膜電位時的時空偽影。使用傳統(tǒng)寬場成像時，由序列采集產(chǎn)生的時空偽影會使測量結(jié)果失真，并影響結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)性。MICA的FluoSync技術(shù)能同時采集并確保時空相關(guān)性，采集時沒有偽影，膜電位與線粒體結(jié)構(gòu)正確相關(guān)。

圖3：MICA的63x/1.2 W PL Apo CS2 SmartCORR物鏡在寬場模式下拍攝的用MitoTracker™綠色（青色）和四甲基羅丹明乙酯（TMRE，品紅）染色的U2OS細胞圖像。A) 序列采集MitoTracker™綠色通道和TMRE通道，其中裁剪圖像顯示由于序列采集兩個通道之間出現(xiàn)了時空偏移。B）同時采集MitoTracker™綠色通道和TMRE通道，裁剪的圖像顯示兩個通道之間沒有任何時空偏移。兩個通道保持共定位，并能夠?qū)γ總€MitoTracker™綠色結(jié)構(gòu)（線粒體結(jié)構(gòu)）中的TMRE信號（線粒體膜電位）進行量化測量。比例尺為5µm。

與傳統(tǒng)的寬場顯微鏡不同的是Mica FluoSync[10]可以同時進行4色標(biāo)簽成像、寬光譜譜檢測和拆分[9] （參加圖4）。

圖4：A) 傳統(tǒng)寬場4色熒光成像使用帶通熒光發(fā)射濾波器：結(jié)果是染料分離度差，導(dǎo)致定位精度低，切斷信號式減少串?dāng)_，序列成像慢。B) 帶FluoSync技術(shù)的MICA可以同時進行4個標(biāo)簽的成像，寬光譜檢測和拆分[9]進行真正的染料分離，以及4倍的同時成像速度。

參考資料

C. Gilbrich-Wille, Consumables for Laser Microdissection: The right solution for every application, Science Lab (2015) Leica Microsystems.
W. Ockenga, An Introduction to Fluorescence, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
W. Ockenga, Fluorescence in Microscopy, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
C.P. Austin, Apoptosis, National Human Genome Research Institute (NHGRI), National Institutes of Health (NIH).
R. Jan, G.-e-S. Chaudhry, Understanding Apoptosis and Apoptotic Pathways Targeted Cancer Therapeutics, Adv. Pharm. Bull. (2019) vol. 9, iss. 2, pp. 205-218, DOI: 10.15171/apb.2019.024.
S. Elmore, Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death, Toxicologic Pathology (2007) vol. 35, iss. 4, pp. 495–516, DOI: 10.1080/01926230701320337.
J.G. Walsh, S.P. Cullen, C. Sheridan, A.U. Lüthi, C. Gerner, S.J. Martin, Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases, PNAS (2008) vol. 105, no. 35, pp. 12815-12819; DOI: 10.1073/pnas.0707715105.
S. Cullen, S. Martin, Caspase activation pathways: some recent progress, Cell Death Differ. (2009) vol. 16, iss. 7, pp. 935–938, DOI: 10.1038/cdd.2009.59.
F. Cutrale, S.E. Fraser, A New Method for Convenient and Efficient Multicolor Imaging: Interview, Science Lab (2022) Leica Microsystems.
FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images: A streamlined approach for simultaneous multiplex fluorescent imaging using a single exposure, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

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